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Thema: In einem unsterilen Raum, steril arbeiten.

 
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Mosaik



Anmeldung: 03.11.2010
Posts: 66
Wohnort: CH-8804 Au ZH

BeitragVerfasst am: 04.11.2011, 15:14
   Titel: In einem unsterilen Raum, steril arbeiten.

Antworten mit Zitat

Die wichtigsten zwei Grundsätze für ein solches Unterfangen heissenn:

MIT MÖGLICHST WENIG GERÄTEN AUSKOMMEN!
JEDES GERÄT KANN EINE KONTAMINATION VERURSACHEN.


MIT MUNDSCHUTZ UND GUMMIHANDSCHUHEN ARBEITEN!
DIE HANDSCHUHE SIND IMMER WIEDER MIT ETHANOL ZU REINIGEN.



Der Siedekolben:
– am Besten eignet sich ein Stehkolben mit drei NS-Hälsen.
Mit 2-Propanol ausschwenken und bei 94°C während MIN. 2 Stunden trocknen.
In den Siedekolben kann ein Magnetrührer gelegt werden.
Der wird gleichzeitig mit dem Kolben steril gemacht.

Mein Siedekolben fasst 250ml. Er hat einen NS-Hals 29/32mm und zwei NS-Hälse 14/23mm.

NS – heisst Normschliff.

Die zu verarbeitenden Komponenten werden direkt in den Stehkolben gewogen.

Für den Aufschluss wird im 29/32 mm Hals ein Kugelkühler als Rückflusskühler aufgesetzt (an einem Stativ anklemmen).
ACHTUNG!
Auch dieser Kühler muss zuvor mit 2-Propanol ausgeschwenkt werden. Dann lässt man ihn trocknen und setzt auf die obere
Öffnung einen nicht ganz schliessenden Stopfen (Druckausgleich beachten). Auch dieser Stopfe soll mit 2-Propanol abgerieben werden.
Mir war eine ganze Charge von Nähragar verdorben, weil ich den Kühler nicht rein hatte.

In die beiden kleinen Hälse werden die Fühler vom Thermometer und vom pH-Meter gesteckt.
Vorher aber, müssen die Elektroden mit 2-Propanol abgewischt werden.

Das Thermometer begleitet den ganzen Siedevorgang.

Das pH Meter wird erst beim Abkühlungsprozess, bei 50°C eingesetzt. Bei dieser Temperatur wird der pH-Wert vom Agar justiert.

Sobald die Sterilisation abgeschlossen ist, werden die Hälse vom Siedekolben mit NS-Stopfen verschlossen.
Diese sollen vorher mit 2-Propanol abgewischt werden.


Die Petrischalen:
Meine Petrischalen haben einen durchmesser von 60mm. Für Privatzwecke benötigt man keine grösseren.
Mit 2-Propanol ausschwenken und geteilt bei 94°C während min. 2 Stunden trocknen.
Den Wärmeschrank geschlossen halten, bis die Siedezeit vom Agar erfüllt ist. Dann werden die Petrischalen, möglichst schnell, geschlossen. Beim Schliessen werden die Deckel nach oben gekehrt und der Boden in den Deckel gelegt.

Hier ist es wichtig, dass man mit Gummihandschuhen arbeitet.

ACHTUNG! – Ränder nicht berühren!
Um die Petrischalen besser transportieren zu können werden sie mit dem Deckel nach unten gelagert.


Die Handutensilien:

Polylöffel für die Einwaage von Pulvern – mit 2-Propanol abwischen.
Die Pulver sollen direkt in den Siedekolben eingewogen werden.

Membranfilter für Sterilfiltration.
Am besten ist, wenn man fertige Membranfilter von 25mmØ und einem Luerlockansatz für PVC Spritzen mit Luerlock-Schraubansatz verwendet.
Die Flüssigkeit wird mit einer PVC-Spritze 10ml, portionenweise, direkt in den Siedekolben filtriert.

Wegen der Kontaminationsgefahr ist es wichtig, dass man die Flüssigkeit nicht über ein weiteres Gefäss in den Siedekolben füllt.


Meine Nähragare
- CASO-Agar MERCK (pH 7,30) in sterlifiltriertem dest. Wasser lösen. Er wird für Bakterienkulturen verwendet.
- KIMMIG-Agar MERCK (pH 6,50) in sterilfiltriertem dest. Wasser lösen. Er wird für Pilzkulturen verwendet.
- KSE-Agar (Knoplösung-Solutio isotonii-Erdabkochung) (pH 5,20) mit neutralem Agar gelieren. Er wird für Algen- und Kleinkryptogamen verwendet.
- Die Kochdauer liegt bei 2 Stunden bei 99°C (inklusive aufheizen).


Die pH-Anpassung:
- 0,5 N HCl in Tropf-Flasche.
- 0,5 N NaOH in Tropf-Flasche.
Je nach pH-Wert wird entweder die Säure oder die Lauge tropfenweise in den Aufschluss geträufelt. Dabei ist der pH-Meter ständig zu beobachten. Das Eintropfen erfolgt über einen NS 14/23mm Hals.
Dazu ist die Thermometerelektrode kurzfristig zu entfernen.
- pH Meter – Elektrode mit 2-Propanol abwischen.
- Temperaturkontrolle - Elektrode mit 2-Propanol abwischen.

Die Salzsäure und die Natronlauge müssen bei dieser niedrigen Konzentration sterilfiltriert werden!

Das Abfüllen ohne Laminar-Flow:
Das Abfüllen erfolgt unter einer grossen Plastikfolie.
Sie muss so gross sein, dass man mit beiden Händen darunter
arbeiten kann, ohne, dass sie allzu stark angehoben wird.

Erst jetzt werden die Petrischalen umgekehrt und der Boden mit dem flüssigen Agar gefüllt.
Petrischalen NICHT bis zum Rand füllen!
Wenn der Agar überläuft, ist eine Kontamination garantiert.

Erfolg ohne Plastikfolie – von 10 Platten waren 5 kontaminiert.
Erfolg mit Plastikfolie – von 10 Platten war 1 kontaminiert.
Die Platten wurden 10 Tage nach der Abfüllung kontrolliert.

VORSICHT BEIM ABFÜLLEN!
Den Abfüllstutzen (ein NS-Hals 14/23mm, vom Siedekolben) nach jeder Petrischale mit 2-Propanol abwischen!

Es darf aber KEIN 2-Propanol auf die Agarplatte kommen, sonst wird sie unbrauchbar.


NEU!

Vor einigen Tagen habe ich eine Einrichtung entdeckt, die sogar einen Laminarflow ersetzen kann.
Der Name heisst GLOY-BAG.
Dabei handelt es sich um einen riesigen Plastikbeutel, bei dem zwei Hanschuhe eingearbeitet sind.
Auf einer Seite ist eine Öffung um die Geräte in diesen Beutel zu legen.
Dann kann man im Schutze vom geschlossenen Beutel mit den Handschuhen von aussen her arbeiten.
Zudem kann man ihn begasen oder so aufpumpen, damit man in einem kleinen Raum arbeiten kann.
Dieses Gerät wird mir für das Abfüllen von Petrischalen dienen.
Aber auch für Manipulationen an Kulturen kann man es benutzen.
Die Plastikfolie ist so robust, dass man sie auch mit Ethanol reinigen kann.
Zudem lege ich immer, bevor ich sie auf die Seite lege, mit Ethanol befeuchtete Papiertaschentücher hinein. Der Ethanoldampf hält den Raum sauber.

Die Aufbewahrung:
Die erstarrten Agarplatten mit einer Vakuumiermaschine in Plastikfolie einschweissen.

Die Agarplatten mit dem Boden nach oben aufbewahren. So verdunstet das Wasser weniger und die Platte bleibt geschmeidig.

Anschreiben vom Inhalt / dem pH-Wert und dem Fabrikationsdatum ist wichtig.

Gut verschlossen sind sie so auch bei Zimmertemperatur lange haltbar.

Haben Sie Fragen?
Nehmen Sie mit mir Kontakt auf!

walter.naenny@bluewin.ch



Glove-Bag Lieferung.jpg
 Beschreibung:
Das ist der Schutzbeutel im Einsatz für Manipulationen mit problematischen Substanzen.
 Dateigröße:  7.13 KB
 Angeschaut:  15958 mal

Glove-Bag Lieferung.jpg



Kimmig-AGAR 0041 gut.jpg
 Beschreibung:
Der Stehkolben mit drei NS-Hälsen.
In der Mitte mit dem Rückflusskühler.
Vor dem Wärmeschrank der pH-Meter mit Temperaturmessung.
Im kleinen Hals links mit der Thermometersonde.
 Dateigröße:  63.72 KB
 Angeschaut:  985 mal

Kimmig-AGAR 0041 gut.jpg




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